Optimización de una técnica de PCR convencional para la amplificación de la región LCR y el gen E6 del virus del papiloma humano tipo 16

El cáncer de cuello uterino es el cuarto cáncer más frecuente en mujeres en el mundo y a nivel mundial, el VPH 16 se encuentra presente en aproximadamente el 60% de los casos. A la fecha, las variantes de VPH 16 se clasifican en 4 linajes y 16 sublinajes asociándose algunas variantes con severidad de lesión. La secuenciación de la región LCR y del gen E6 es utilizada para la clasificación de variantes. Por ello, el objetivo fue optimizar 2 PCRs convencionales para detectar la región LCR y una PCR para el gen E6. Para ello, se utilizaron muestras positivas para VPH 16, cebadores específicos para la región LCR y el gen E6. Se probaron las reacciones a diferentes temperaturas de anillamientos. La concentración de MgCl2, dNTP y cebadores fueron determinadas siguiendo las recomendaciones del fabricante de la enzima ADN polimerasa utilizada. Para la amplificación de la región LCR y el gen E6 del VPH 16, se observaron mejores resultados a una temperatura de anillamiento de 57°C y 50°C, respectivamente. La concentración de MgCl2 utilizada en ambas reacciones fue de 1,5mM, la de dNTP 0,2mM y la de cebadores 0,2uM. La optimización de la reacción de PCR permitirá obtener amplicones aptos para secuenciación, a fin de determinar las variantes génicas y posteriormente evaluar funcionalidad y actividad transcripcional que puedan estar relacionadas con la patogénesis cervical.

Cervical cancer is the fourth most common cancer in women in the world and worldwide HPV 16 is present in approximately 60% of cases. To date, HPV 16 variants are classified into 4 lineages and 16 sublineages, with some variants being associated with lesion severity. Sequencing of the LCR region and the E6 gene is used for variant classification. Therefore, the objective was to optimize two conventional PCRs to detect the LCR region and one PCR for the E6 gene. For this purpose, HPV 16 positive samples, specific primers for the LCR region and the E6 gene were used. The reactions were tested at different alignment temperatures. The concentration of MgCl2, dNTP, and primers was determined following the recommendations of the manufacturer of the DNA polymerase enzyme used. For amplification of the LCR region and the HPV 16 E6 gene, the best results were observed at an annealing temperature of 57°C and 50°C, respectively. The concentration of MgCl2 used in both reactions was 1.5mM, dNTP 0.2mM and primers 0.2uM. The present optimization will be used to sequence the amplified products to determine the variants and subsequently evaluate the functionality and transcriptional activity in order to relate it to cervical pathogenesis.

Optimización de una técnica de PCR convencional para detección de virus de papiloma humano tipo 16 y 18 / Optimization of a conventional PCR technique for detection of human papillomavirus type 16 and 18

El cáncer de cuello uterino es el segundo cáncer femenino más común a nivel mundial. El agente causal es el virus de papiloma humano (VPH). Se han identificado 13 tipos de virus de papiloma humano de alto riesgo oncogénico (VPH-AR), entre los cuales el VPH 16 y VPH 18 son los más frecuentemente detectados en cáncer de cuello uterino, siendo en Paraguay detectados en el 70% de casos de cáncer invasor. Por ello, el objetivo fue estandarizar y determinar el límite de detección de una técnica de PCR convencional para la detección de VPH 16 y 18. Para la detección de ADN de VPH 16 y 18, se observaron mejores resultados con 2mM de MgCl2 y 60°C para la temperatura de alineamiento. El límite de detección para las PCR fue de 14,6x10-11ng/µL para VPH 16 y 21,7x10-12ng/µL para VPH 18. Este trabajo servirá de base a otros estudios de detección e identificación de estos tipos virales por PCR, con miras a identificar un grupo de mujeres positivas para VPH-AR que poseen mayor riesgo de desarrollo de lesión y cáncer de cuello uterino y precisan de un seguimiento más cercano(AU

Cervical cancer is the second most common female cancer worldwide. It is caused by the human papilloma virus (HPV). Thirteen genotypes of high oncogenic risk human papilloma viruses (HPV-HR) have been identified, among which types 16 and 18 are the most frequently detected in cervical cancer. In Paraguay, they are detected in 70% of the invasive cancer cases. Therefore, the objective was to standardize and determine the detection limit of a conventional PCR technique for the detection of HPV 16 and 18. Better results were observed with 2mM MgCl2 and 60°C for the alignment temperature in detection of HPV 16 and 18 DNA. The limit of detection was 14.6x10-11ng/µL for HPV 16 and 21.7x10-12ng/µL for HPV 18. This work will help other studies for the detection and identification of these viral types by PCR in order to identify a group of HPV-HR positive women who have higher risk for the development of lesions and cervical cancer and need a closer follow-up(AU)

Epidemiología molecular del Virus del Papiloma Humano detectado en cuello uterino de mujeres indígenas del Departamento de Presidente Hayes -Paraguay, periodo 2010-2011 / Molecular epidemiology of human papillomavirus in cervical detected indigenous women Presidente Hayes department, Paraguay, period 2010-2011

El Paraguay ocupa el séptimo lugar en incidencia de cáncer de cuello uterino en las Américas y el caribe, siendo el virus del papiloma humano (HPV) suagente causal. Considerando que las mujeres indígenas poseen menor acceso a sistemas de salud, inicio temprano de relaciones sexuales, bajo nivel de educación, características que podrían favorecer el desarrollo de lesiones cervicales, el objetivo del presente estudio transversal analítico fue, determinar la frecuencia de tipos de HPV y lesiones de cuello uterino en 181 mujeres índigenas del Departamento de Presidente Hayes - Paraguay, periodo 2010/2011. Las mujeres pertenecieron a las siguientes etnias: Maká (n=39); Nivaclé (n=18); Sanapaná (n=33); Enxet Sur (N=57) y Toba-Qom (n=34). Los tipos de HPV se detectaron por reacción en cadena de la polimerasa seguida de hidridación reversa y las lesiones de cuello uterino, por citología. La frecuencia de HPV fue 23,2% (42/181 mujeres). En 9,4% de las mujeres (17/181) se observó infección múltiple. El HPV 16 (4,4%) fue el más frecuente seguido por HPV 58 (3,3%, HPV 45 (3,3%), HPV 53 (",8%) y HPV 11 (",8). No se observó lesión de cuello uterino. Hubo asociación estadísticamente significativa entre la presencia de infección por HPV, un inicio temprano de relaciones sexuales (p=0,018) y un número de parejas sexuales mayor a 2 (p=0,028). Los datos obtenidos permitieron conocer los tipos de HPV circulantes en la población, lo cual contribuirá a la vigilancia de estos post vacunación y a optimizar las Poliíticas de Salud Pública destinadas a la detección y prevención del cáncer.